光學(xué)顯微鏡技術(shù)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)zui重要的工具，在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用。近年來，隨著多種現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)與光鏡技術(shù)的結(jié)合，使光學(xué)顯微鏡展示出更新的活力。目前光學(xué)顯微鏡已發(fā)展成多種類型，用于各類不同的研究目的。在細(xì)胞生物學(xué)中常用的有普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、相差顯微鏡，以及暗視野顯微鏡和微分干涉差顯微鏡。 
（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù) 
普通光學(xué)顯微鏡（簡稱光鏡）是zui常使用的顯微鏡，主要由三部分組成：聚光鏡、物鏡和目鏡。光鏡采用可見光作光源，分辨率為0.2µm，放大倍率為1000倍，其他幾種顯微鏡都是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。 
用于普通光學(xué)顯微鏡觀察的生物樣品必須應(yīng)過一系列的組織處理并制成1～10µm的切片。常規(guī)的樣品制備方法是：甲醛固定，酒精脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精（hematoxylin）和伊紅（eosin）染色，光鏡觀察。 
普通光學(xué)顯微鏡能觀察染色的生物標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，主要是因?yàn)楣饩€通過染色標(biāo)本時其顏色（光波的波長）和亮度（光波的振幅）發(fā)生變化，人的眼睛才能觀察到。 
（二）熒光顯微鏡技術(shù) 
熒光顯微鏡（fluorescentmicroscope）是以各種特定波長光源激發(fā)生物標(biāo)本中的熒光物質(zhì)，產(chǎn)生各種可見顏色熒光的一種顯微鏡。熒光顯微鏡一般采用高壓汞燈和弧光燈作為光源，在光源和反光鏡之間放一組濾色片以產(chǎn)生特定波長的激發(fā)光，光譜一般從紫外到紅外，從而激發(fā)各種熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光。利用熒光顯微鏡可研究熒光物質(zhì)在組織和細(xì)胞內(nèi)的分布，以達(dá)到對細(xì)胞的特定物質(zhì)進(jìn)行定性、定位和定量觀察的目的。與生物學(xué)有關(guān)的熒光現(xiàn)象有三種： 
⑴自發(fā)熒光通過激發(fā)光會使物體發(fā)出熒光，如葉綠素、維生素A等。 
⑵誘發(fā)熒光通過誘導(dǎo)劑作用而發(fā)的熒光，如甲醛蒸氣處理可誘發(fā)細(xì)胞和組織中生物單胺類產(chǎn)生熒光。 
⑶熒光染料染色熒光例如吖啶橙可以對細(xì)胞DNA、RNA同時染色，顯示不同顏色的熒光，DNA呈綠色熒光，RNA呈橙色熒光。熒光染料可和抗體共價鍵結(jié)合，這種標(biāo)記的抗體再和相應(yīng)的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)激發(fā)后發(fā)射熒光進(jìn)行抗原定位。 
由于熒光顯微鏡技術(shù)染色簡便、敏感度高而且圖像色彩鮮明，所以是目前對特異蛋白質(zhì)等生物大分子定性、定位的有力的工具。 
（三）相差顯微鏡技術(shù) 
相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）是一種可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本的顯微鏡。相差顯微鏡能夠改變直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變成振幅差（明暗差），同時它還吸收部分直射光線以增大其明暗反差。因此可以觀察活細(xì)胞或未經(jīng)染色的標(biāo)本。 
相差顯微鏡與普通顯微鏡的主要區(qū)別是在物鏡后裝有一塊“相差板”，偏轉(zhuǎn)的光線分別通過相差板的不同區(qū)域，由于相差板上部分區(qū)域有吸光物質(zhì)，所以又使兩組光線之間增加了新的光程差，從而對樣品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。zui后這兩組光線經(jīng)過透鏡又會聚成一束，發(fā)生互相疊加或抵消的干涉現(xiàn)象，從而表現(xiàn)出肉眼明顯可見的明暗區(qū)別。 
觀察活體細(xì)胞常采用倒置相差顯微鏡，它與一般相差顯微鏡的不同是光源和聚光器裝在上方，相差物鏡裝在載物臺下方，便于觀察在培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，這樣可清楚地分辨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞核、核仁以及胞質(zhì)中存在的顆粒，甚至研究細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器的動態(tài)。 
（四）微分干涉差顯微鏡技術(shù) 
微分干涉差顯微鏡（differentialinterferencecontrast）又稱Nomarski相差顯微鏡，其優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)。 
微分干涉差顯微鏡利用的是偏振光，這些光經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后在經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從樣品中厚度上的微小區(qū)別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差并且具有很強(qiáng)的立體感。 
微分干涉顯微鏡能使細(xì)胞核及較大的細(xì)胞器如線粒體等具有較強(qiáng)的立體感，比較適合于顯微操作。目前多用于基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因動物等生物工程的顯微操作。將微分干涉差顯微鏡接上錄象機(jī)，可以觀察活細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動。 
（五）激光掃描共焦顯微鏡 
激光掃描共焦顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM），也被稱為激光掃描細(xì)胞儀（laserscanningcytometer，LSC）。自20世紀(jì)70年代問世以來很快得到迅速發(fā)展，成為分子細(xì)胞生物學(xué)的新一代研究工具。激光掃描共焦顯微鏡在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共扼聚焦裝置和檢測系統(tǒng)，整套儀器均由計算機(jī)自動控制，軟件監(jiān)控和執(zhí)行各組件之間的切換。生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中LSCM的顯微鏡以倒置顯微鏡為主，便于活細(xì)胞檢測。與普通光鏡和熒光顯微鏡相比有一些明顯的優(yōu)點(diǎn)，其中主要有： 
（1）普通顯微鏡使用的光源為鹵素?zé)?，光譜范圍寬，成象時樣品上每個照光點(diǎn)均 
會受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成象質(zhì)量。LSCM的光源為激光，是單色性好的平行光，基本消色差，成象聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強(qiáng)度測量。 
（2）普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖象結(jié)構(gòu)為多層面的圖象迭加，結(jié)構(gòu)不夠 
清晰。LSCM結(jié)構(gòu)上采用雙針孔（pinhole）裝置，形成物象共扼的*設(shè)計（如圖2－2所示）。激光通過聚光鏡焦平面上針孔形成點(diǎn)光源經(jīng)物鏡在焦平面上對樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，樣品上每個照射點(diǎn)，反射后經(jīng)過物鏡折射到像焦平面的探測針孔處成像，經(jīng)空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點(diǎn)形成的雜散熒光和樣品的不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。每個像點(diǎn)被光電倍增管（PMT）或冷電感藕合器件（cCCD）探測器接收。因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)物象共扼，只有物鏡焦平面上的點(diǎn)經(jīng)針孔空間濾波才能形成光點(diǎn)圖象，掃描后可得到信噪比*的光學(xué)橫斷面，分辨率比普通光學(xué)顯微鏡提高1.4倍。LSCM能以0.1um的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描，得到一組光學(xué)切片，不同焦平面的光學(xué)切片經(jīng)三維重建后能得到樣品的三維立體結(jié)構(gòu)，這種功能被形象地稱為"顯微CT"。 
（3）LSCM的高靈敏度、高分辨率和高放大倍數(shù)，減少了光淬滅的影響，提供了 
普通光學(xué)顯微鏡無法顯示的結(jié)構(gòu)信息，并適用于達(dá)到毫秒級的快速變化檢測。 
LSCMzui常用的功能是熒光檢測、三維重建和顯微操作等。其中熒光檢測覆蓋的內(nèi)容極為廣泛，通過多種熒光探針或熒光連接抗體，可對細(xì)胞內(nèi)離子、pH值、各種蛋白質(zhì)分子進(jìn)行動態(tài)測定。另外利用激光掃描還可以對細(xì)胞進(jìn)行特殊操作，例如光刀切割法（cookie-cutter）作粘附細(xì)胞分選（adheredcellsorting），能殺滅不需要的細(xì)胞，保留所選細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)；激光光陷阱技術(shù)（又稱為光鑷技術(shù)）對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行非接觸式的捕獲和固定，并進(jìn)行操作；激光作為光子刀可以用來完成細(xì)胞膜瞬間打孔以及對線粒體、溶酶體、染色體和神經(jīng)元突起的切割等顯微細(xì)胞外科手術(shù)。

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